Extração de DNA em sala de aula

Adaptado do texto de Valesca Veiga Cardoso Casali, Emerson A. Casali e Carlos Augusto B.M. Normann, publicado originalmente em NORMANN, CABM (ORG.) Práticas em biologia celular. 2. ed. Porto Alegre: Sulina; Porto Alegre: Editora Universitária Metodista IPA, 2017. 303 p. Uso para trabalhos escolares permitido, desde que citando a fonte e os autores e autora.

Introdução

Macromoléculas de grande relevância biológica, os ácidos nucleicos, são usados pelas células de todos os organismos vivos para fornecer as instruções sobre os processos celulares, além de estocarem e transmitirem essas informações. A informação genética é decifrada através de um código genético, cuja tradução resulta na síntese proteica.

Existem dois tipos de ácidos nucleicos, ácido desoxirribonucleico (DNA) e o ácido ribonucleico (RNA). Eles são polímeros lineares de monômeros de nucleotídeos unidos por ligações fosfodiéster. Existem quatro tipos diferentes de nucleotídeos tanto no DNA quanto no RNA. Os nucleotídeos são

compostos de um grupo fosfato, uma pentose (açúcar) e uma base nitrogenada (púrica e pirimidínica), todos esses unidos por ligações covalentes. A pentose do DNA é a desoxirribose, e a do RNA é uma ribose. As bases adenina, guanina e citosina estão tanto no DNA quanto no RNA, mas timina somente é encontrada no DNA, e a uracila no RNA.

Watson e Crick, em 1953, propuseram o modelo tridimensional do DNA baseado nos estudos de Franklin e Wilkins. Esse modelo demonstra que o DNA é uma dupla hélice e que duas fitas de DNA se enrolam em torno do eixo das hélices. O DNA das células eucariontes apresenta três frações caracterizadas pelo grau de repetição, apresentadas na sequência.

DNA singular ou de cópia única

Constitui a maior parte do DNA no genoma. As sequências que codificam proteínas (isto é, a porção codificadora dos genes) compreendem apenas uma pequena proporção do DNA de cópia única.

A maior parte do DNA de cópia única encontra-se em extensões curtas, entremeadas com diversas famílias de DNA repetitivo. Proporção do genoma: 75%.

DNA repetitivo disperso

Consiste em sequências relacionadas que se espalham por todo o genoma, em vez de ficarem localizadas. Os elementos repetidos dispersos mais exatamente estudados pertencem à família Alu e à família L1.

Família Alu

Tem essa denominação porque a maioria dos seus membros é clivada por uma endonuclease de restrição bacteriana denominada Alu I, instrumento importante da tecnologia do DNA recombinante. Os membros dessa família têm um comprimento de cerca de 300 pares de bases e são relacionados uns aos outros, mas não exibem uma sequência idêntica. No total existem cerca de 500.000 membros da família Alu no genoma, estimando-se que constituam 3% do DNA humano.

Família L1

Constitui sequências repetidas longas encontradas em cerca de 10.000 cópias por genoma. Assim, embora haja muito menos cópias nessa família do que na Alu, seus membros são bem mais longos, e a contribuição para a constituição do genoma é cerca de 3%.

DNA satélite

Envolve sequências repetidas (em tandem) agrupadas em um ou em alguns locais, intercaladas com sequências de cópia única ao longo do cromossomo. As famílias de DNA satélite variam quanto à localização no genoma, comprimento total da série em tandem e comprimento das unidades repetidas que constituem a série.

As técnicas e as manipulações ligadas aos ácidos nucleicos têm sido grandemente exploradas desde a década de 1970; hoje, essas técnicas têm fornecido à ciência, à medicina e à indústria grandes avanços.

Extrair e isolar ácidos nucleicos de tecidos em quantidade suficiente e integridade são essenciais na prática da biologia molecular. Neste blogue, descreveremos uma metodologia de fácil reprodução, através de uma técnica de baixo custo e facilmente multiplicável, em especial em escolas de Ensino Médio e Fundamental. É uma adaptação da metodologia de Diane Sweeney Labs Biology: Exploring Life© Pearson Education.

Objetivos

Permitir extrair ácidos nucleicos de células de pseudofrutos de morango, que podem ser facilmente utilizados em sala de aula porque são muito macios e fáceis de homogeneizar. Compreender a função dos passos da técnica, bem como dos reagentes envolvidos.

Materiais

Amostra de tecido vegetal (um ou dois morangos), estilete, placa de petri, bastão de vidro, banho-maria 60 °C, erlenmeyer, proveta, tubos de centrífuga ou ensaio, funil, papel-filtro, álcool gelado (96%), NaCl, detergente, água destilada.

Procedimentos

1. Preparação do tampão de extração: misture em um tubo de centrífuga ou ensaio 6 ml de detergente e 3 gramas de NaCl, complete para 50 ml com água destilada (com o uso de proveta se possível). Aqueça o tampão em banho-maria a 60^oC.

2. Picar em uma placa de Petri um ou dois morangos (sem as sépalas) em pedaços pequenos.

3. Adicionar a amostra no tampão de extração aquecido.

4. Deixar em banho-maria a 60 ºC por 10 minutos.

5. Filtrar a mistura com papel-filtro, recuperando o filtrado em um erlenmeyer (ou em um frasco de vidro), que deve ser resfriado.

6. Adicionar álcool gelado (96%) ao filtrado, deixando o álcool escorrer pela parede do vidro LENTAMENTE. Formam-se duas fases, a superior, alcoólica e a inferior, aquosa.

7. Misture as fases e observe a formação de fios esbranquiçados, que são aglomerados de moléculas de ácidos nucleicos (DNA e RNA e polissacarídeos).

A extração de ácidos nucleicos de células eucariontes consta fundamentalmente de duas etapas:

• Ruptura das células para liberação dos núcleos, que é feita pela ação do detergente sobre os lipídios da membrana.

• Desmembramento dos cromossomos em seus componentes básicos, DNA e proteínas: feito a partir da saturação com o sal de cozinha, bem como pelos íons fosfato presentes no detergente. O morango é usado por apresentar células grandes, que se rompem quando são picados. O detergente desagrega os envelopes nucleares e as membranas das células, liberando o DNA. Um dos componentes do detergente, o dodecil (ou lauril) sulfato de sódio, desnatura as proteínas, separando-as do DNA cromossômico. O álcool gelado, em ambiente salino, faz com que as moléculas de DNA se aglutinem, formando uma massa filamentosa e esbranquiçada.