Uso do microscópio

Anatomia e Funcionamento do Microscópio:

Observe o microscópio. Identifique as partes apresentadas na fotografia abaixo, bem como suas funções:

1. Ocular: é onde você irá realizar a observação. Em uma delas, temos um ajuste, a fim de corrigir pequenos desvios de visão (miopia, hipermetropia), que distorceriam o foco da imagem em trabalho. Evite encostar os dedos nela, uma vez que sempre, por mais bem lavada que seja a mão, haverá algum resíduo de gordura, típico da pele humana. Caso a mesma apresente-se suja, solicite ao/à professor/a um pedaço de algodão e um pouco da solução de limpeza, para permitir uma observação qualificada.

Note que há alguns números descritivos da lente. Em geral, a ampliação conferida pela ocular é de 10 vezes sobre o tamanho da imagem observada. A ocular irá, portanto, ampliar a imagem formada pela objetiva. Multiplique este valor pelo da capacidade de aumento da objetiva, como veremos adiante.

2. Objetivas: elas se encontram no revólver. O revólver é giratório, e nele há quatro objetivas, que são formadas por conjuntos de lentes sobrepostas (de 4 a 6), corrigindo defeitos ópticos e permitindo uma correta ampliação da imagem em análise. Objetivas de má qualidade muitas vezes permitem que se formem círculos coloridos ao redor do material observado, as chamadas linhas de Fresnel, distorcendo a observação. Objetivas de boa qualidade, portanto, são essenciais numa boa observação ao microscópio.

Em geral, utilizam-se quatro objetivas: uma panorâmica (4x), uma de aumento médio (10x), uma de aumento grande (40x) e uma especial, que permite um aumento maior ainda, mas necessita o uso de óleo mineral, em função de sua abertura numérica (100x). Esta objetiva especial é também chamada de lente de imersão.

3. Platina ou mesa: é onde colocamos a lâmina para trabalhar, presa por uma pinça. A mesa será elevada ou abaixada pelos parafusos macro e micrométrico, a fim de ajustar o foco sobre o material que estamos observando.

4. Charriô: do francês charriot, é o jogo de parafusos que permite que a lâmina presa pela pinça seja deslizada ao longo da mesa ou platina, facilitando a análise do material em estudo.

5. Diafragma e Condensador: O condensador é formado por duas ou mais lentes convergentes, que concentram a luz que vem de uma fonte situada abaixo, focalizando-a no objeto em análise, permitindo, pois, que as objetivas ampliem a imagem. O condensador apresenta um diafragma em íris, que é regulável. O diafragma permite regular a passagem de mais ou menos luz pelo condensador, na medida em que o trabalho a demande. Quando utilizamos objetivas de maior poder de aumento, é necessário abrir mais o diafragma do condensador, ou seja, permitir que haja um aporte maior de luz ao objeto, a fim de que se obtenha o máximo poder de resolução da imagem em análise.

6. Parafusos: os microscópios que utilizamos apresentam um sistema de parafusos, a fim de que se faça uma aproximação mais grosseira do objeto (macrométrico) ou mais delicada (micrométrico).

7. Fonte luminosa: situada na base do microscópio, ela irá gerar a luz para nossas observações. Convém regular a quantidade de luz no máximo, para obter o melhor de nossas análises.

Utilizando o microscópio:

O microscópio de luz apresenta capacidades e limites, que permitem que ele seja um interessante instrumento de pesquisa e aprendizado. Podemos visualizar estruturas celulares, até um certo limite, que é dado pelo poder, ou limite, de resolução do microscópio. Essa propriedade, o limite de resolução, é a capacidade de distinguir nítida e separadamente dois pontos adjacentes. O limite de resolução (LR) do microscópio de luz depende do comprimento de onda (λ) da radiação utilizada e da abertura numérica (a.n.) da objetiva. Pode ser calculado pela seguinte equação:

L.R. = λ.K / an

Donde:

K = constante de Richardson (0,61)

λ = comprimento de onda da luz (considere 550 nm como comprimento de onda para fins de cálculo)

an = abertura numérica

A abertura numérica é a medida da capacidade de uma lente para receber informação (luz) de um objeto e é definida pela equação: a.n. = n . sen θ, onde n é o índice de refração do meio entre o objeto e a objetiva (n=1 para o ar, n=1,33 para a água e n=1,5 para o vidro e para o óleo de imersão), e onde θ é o semi-ângulo de abertura, formado pelo eixo óptico e os raios externos do feixe de luz que penetram na objetiva.

As objetivas que trabalham a seco apresentam íncide de refração de 1,0 (ou seja, o mesmo do ar). Já nas lentes de imersão, é necessário o uso do óleo, que permite trabalhar um aumento mais pesado, sem perda de resolução. Quando um aluno/a inadvertidamente tenta utilizar a lente de imersão sem o óleo, além de correr o risco de danificar equipamento e material de estudo, está sub-utilizando a objetiva, que irá trabalhar com uma imagem muito mais rica em resolução e detalhes com o uso do óleo.

De acordo com o que informamos acima, utilize a fórmula de cálculo de Poder de Resolução e complete a tabela abaixo, observando os dados do microscópio que você irá utilizar na aula prática, considerando uma ocular de 10 x:

Características	Objetivas “a seco”			Objetiva de imersão
Ampliação da objetiva	4x	10x	40x	100x
Ampliação total
Abertura numérica	0,10	0,25	0,65	1,25
Limite de resolução (μm)

Algumas recomendações:

• Se precisar remover o equipamento, segure-o firmemente com uma das mãos no braço e outra na base. Coloque-o bem apoiado sobre a mesa de trabalho de superfície plana, evitando qualquer movimentação brusca. Nunca desloque o aparelho com a lâmpada acesa, ou logo após ter sido apagada, nem o arraste!

• Se o/a professor/a solicitar alguma observação em preparação de meio líquido, como numa suspensão para visualizar protozoários, rotíferos, microcrustáceos, bactérias, algas, etc, cuide, pois há sempre o risco de molhar a lente frontal da objetiva; portanto o conselho é retirar o excesso de líquido com papel de filtro, antes de colocar a lâmina sobre a platina; em de acidente, enxugue imediatamente com papel absorvente macio.

• A imagem que vemos no microscópio é aumentada, virtual e invertida em relação ao objeto analisado. Portanto, ao procurar um determinado local no campo de observação, leve em conta que a imagem que é visualizada na ocular é invertida em sua localização na mesa, sendo necessário ter esse cuidado na busca dos melhores campos de observação.

• Inicie a observação sempre pela lente de menor aumento. A ampliação é dada pelo produto do valor do aumento da ocular pelo da objetiva. Assim, se sua objetiva menor tem uma capacidade de aumento de quatro vezes, sua observação será feita em um aumento de 10 x 4, ou seja, 40 vezes o tamanho do objeto na lâmina. O aumento menor permite uma visão panorâmica da lâmina, e assim você irá optar pelo campo mais conveniente para a observação que o/a professor/a lhe solicitou.

• Realize a calibração de Köhler para obter o máximo poder de resolução das objetivas de seu aparelho. Para isso, siga os passos abaixo:

1. Fechar o diafragma ao máximo e focalizá-lo, mexendo no condensador. Aparecerá uma imagem com facetas planas.
2. Centralizar a imagem acima, com os parafusos de centralização.
3. Abrir o diafragma até iluminar uniformemente o campo.

• Escolha uma estrutura na preparação, mova a lâmina até que o objeto fique exatamente no centro do campo. Uma vez focalizada, mude para a objetiva de aumento imediatamente maior, olhando por fora para evitar o choque com a lamínula, em caso de visualização por aumento de 40 vezes. Procure o foco com vagar, para ter segurança no que é observado. Se a imagem parece embaralhada e confusa, verifique o foco, subindo ou descendo o micrométrico, a fim de refinar o foco.
• O uso da objetiva de imersão é mais delicado, pois a distância focal entre a face da objetiva e a parte superior da lamínula diminui muito quando a ampliação é aumentada. É necessária uma gota de óleo de imersão, que aumenta o poder de resolução da objetiva. Após colocar o óleo, abaixe o tubo até colocar a lente em contato com a gota ainda convexa, até a mudança de forma da mesma; suspenda levemente o tubo, mas sem perda de contato com a gota, coloque os olhos nas oculares e abaixe o tubo muito calmamente; assim que a imagem aparecer, complete a focalização com o micrométrico.
• Nem sempre os resultados são os esperados. É comum que o docente seja chamado por algum/a aluno/a que não está vendo nada no microscópio. Para isso, faça um pequeno checklist:

a) Verificou se a tomada está ligada corretamente, de acordo com a voltagem especificada no aparelho?

b) O interruptor está ligado ou desligado?

c) O potenciômetro da luz está no mínimo, aparentando mau funcionamento?

d) A objetiva e a ocular estão corretamente alinhadas?

e) O foco está corretamente feito?

f) A lâmina está com a lamínula para cima?

g) As lentes estão limpas? Caso não estejam, use um pouco de álcool-éter embebido num algodão, ou papel filtro seco, e passe delicadamente nas objetivas e oculares.

Regulagem da iluminação

Nos microscópios de condensadores móveis, para verificar a centralização, feche completamente o diafragma e examine a imagem com a objetiva de menor aumento focalizada numa preparação; em microscópios que possuem condensador de campo (por onde passam os feixes de luz), este também deve ser fechado, reduzindo assim o cone de luz.

Em ambos os casos a centralização é feita girando os parafusos laterais do condensador até que a íris do diafragma esteja exatamente no centro, ou seja, coincidindo com o eixo óptico do sistema de lentes.

A imagem da íris do diafragma, uma vez centralizada, deve ser regulada movimentando o condensador, para cima ou para baixo, até que sua borda azulada esteja nítida; abre-se então o condensador de campo ou o diafragma para preencher todo o campo, obtendo-se assim um feixe luminoso exatamente centrado. Esta iluminação crítica ou de Köhler, como citamos acima, é portanto, obtida quando o condensador focaliza a luz no objeto e a luz transmitida do objeto para a objetiva quase que preenche completamente as lentes.

Cortes e colorações

Para uma análise adequada dos materiais ao microscópio, é necessário que os mesmos estejam cortados com a menor espessura possível, e corados, de modo a identificar as estruturas em visualização. Os cortes são feitos em um micrótomo, que irá seccionar o material em espessura que varia dos 0,5 m a 20 m, conforme o tipo de observação que faremos e conforme o meio de inclusão do material. A parafina, meio de inclusão mais utilizado, permitirá cortes entre os 5 e os 7 m de espessura. Inclusões em plásticos, como o glicol-metacrilato, as resinas epóxi e outros, no entanto, permitem que sejam observados os tecidos em cortes mais delgados ainda, até a casa dos 0,5 m.

Devido à pequena espessura dos cortes, eles se tornam muito transparentes. Para podermos analisar as células e demais componentes do tecido, é fundamental, portanto, que utilizemo-nos de corantes. Os corantes apresentam propriedades químicas que conferem uma maior ou menor afinidade com os componentes formadores dos tecidos. Assim, os componentes básicos dos tecidos, como os radicais amino dos aminoácidos, apresentarão uma propriedade denominada acidofilia. Isso significa que irão desenvolver ligações eletrostáticas com corantes que apresentem radicais ácidos, como a eosina. Este corante confere coloração rósea aos substratos aos quais se liga.

Já os ácidos nucléicos, os proteoglicanos e glicosaminoglicanos, a pectina da parede celular vegetal, entre outros componentes, de natureza ácida, irão apresentar grande afinidade pelos corantes básicos, como o azul de toluidina, o azul de metileno e outros, amplamente utilizados. O corante básico mais utilizado em nosso laminário é a hematoxilina, que confere aos componentes ácidos da célula uma coloração roxa, bastante conspícua. Alguns corantes básicos, como o azul de toluidina, apresentam coloração diferenciada, de acordo com a quantidade de ligantes presentes nas moléculas formadoras das estruturas em observação. Assim, podemos ter cortes com áreas coradas com o azul de toluidina, mas em verde, quando são menos disponíveis os ligantes; em caso de abundantes sítios de ligação a tais moléculas, a coloração passa a um roxo intenso. Essa propriedade chamase metacromasia.